碱性添加剂和鸟苷/葡萄糖酸盐在浓缩红细胞储存溶液中的代谢作用

碱性添加剂和鸟苷/葡萄糖酸盐在浓缩红细胞储存溶液中的代谢作用

前言：

浓缩红细胞是指从新鲜全血中去除了一部分液体成分，使红细胞的浓度增加，得到一种高红细胞浓度的制品，研究发现新型添加剂如AS-7（商业名称SOLX）10或赤溶胶-5（ESOL5）11设计基于氯化物移位的概念。

通过促进低氯化物/无氯化物/高碳酸氢盐添加剂中的氯化物外排来促进细胞内pH碱化-对能量和氧化还原代谢有益，通过用含有膜不渗透性阴离子（如葡萄糖酸钠）的盐代替盐水成分可以获得类似的效果，这会产生可逆的细胞内碱中毒。

血液采集、处理和储存

血液采集、处理和储存详见别处。简而言之，从健康的志愿者献血者（n=500）中收集了15mL的CPD抗凝剂血液。对于每个系列，由5个ABO兼容的混合血液单位组成的三个系列的重复被拆分，血浆和血沉棕黄层脱落。

随后加入110mL的各种添加剂溶液SAGM、E-SOL5、PAGGSM、SOL-X（AS-7）或PAGGGM（均在内部制备），然后减少白细胞（1x106剩余的白细胞）。

在储存第1、21、35天和56天对单位进行无菌取样。该采样时间表背后的基本原理来自以下观察结果：“在E-Sol2和AS-3中储存期间抑制了5，7DPG的下降，而在PAG3M中，2，3-DPG水平在初始水平以上增加到第35天，并且直到第56天仍可检测到。

在这里，我们想测试这些对2，3-DPG的观察是否也可以扩展到其他代谢途径。在每个时间点以2，000g离心10分钟，在4°C下分离红细胞和上清液，并将红细胞沉淀冷冻运送到代谢组学设施进行处理，如下所述进行代谢组学分析。

代谢物提取

在50μl裂解缓冲液（甲醇：乙腈：水450：5：3）中提取2μl包装红细胞的体积，然后在30ºC下涡旋4分钟进行冰冷提取。38，47通过离心（在10ºC和4，10×g下000分钟）沉淀不溶性蛋白质，收集上清液并储存在-80°C直至分析。

UHPLC-MS代谢组学

使用VanquishUHPLC系统在线耦合到QExactive质谱仪进行分析。样品在KinetexC18色谱柱）在25ºC下，使用5%乙腈，95%水和0.1%甲酸的三分钟等度条件，以250μl/min的速度流动，48或从9-400%B（A：水/5.95%甲酸;B：乙腈/0.1%甲酸）。

统计分析

使用（GraphPadSoftware，Inc，LaJolla，CA）和进行了图形和统计分析，包括偏最小二乘判别分析（PLS-DA）和双因子（时间序列+单因子统计分析）。49通过GraphPadPrism对所有测试存储天数（三阶多项式）的可用数据点进行插值，从而执行线图。

最近已经描述了代谢连锁分析。50简而言之，使用和MicrosoftExcel0进行了相关分析（Pearson或Spearman相关性–r-使用Kolmogorov-Smirnov测试数据的正态分布）和Δ|r|2017%偏差的计算，而结果则使用GENE-E绘制。

简而言之，代谢连锁分析的基本假设50即使相关性并不一定意味着因果关系，来自连接途径的代谢物水平也是高度相关的，这是由于消耗一种代谢物以产生另一种代谢物所必需的酶促反应的生化限制。

气体和离子稳态、渗透脆弱性、PS暴露和形态

测量不同添加剂中储存的红细胞的血细胞比容、平均细胞体积（MCV）、pH值、溶血百分比、渗透压脆性、磷脂酰丝氨酸（PS）暴露和形态改变（报告为棘皮细胞的百分比）（部分先前报道过）46并在补充图1和图2中重新阐述）。

尽管由于缺乏红细胞储存质量和输血功效的功能体内测量（例如输血后恢复）的限制，但我们在这里测量的参数代表了“功能”相关性的重要替代指标（例如自发性和渗透性溶血的百分比）。在整个储存过程中，SAGM红细胞的平均细胞体积（MCV）最高。

SAGMRBC的储存渗透压脆性最高，在储存期间呈增加趋势（与之前的观察结果一致）51），而其他添加剂则呈下降趋势（补充图1）。各种添加剂中的碱化是通过高碳酸氢盐负荷（SOLX）、低氯化物（PAGGSM）或无氯化物（PA3GM、SOLX和ESOL-5–补充图2）实现的。

与SOLX和ESOL-3相比，PAG5M和PAGGSM的储存pH值较低，尽管所有添加剂的趋势大多相当。ESOL-5和PAG3M显示出最低的储存溶血端和最高的PS暴露，尽管所有添加剂在整个储存过程中的形态分析中显示出相似的棘皮细胞百分比。

代谢组学–概述

结果在补充表1中广泛报告。对所有添加剂的代谢趋势进行分层聚类，并在图1.在这些代谢表型的基础上，我们通过偏最小二乘判别分析，表明PAG4M是唯一没有显示我们和其他人之前描述的PC3和1的典型U形级数的添加剂。

通过经典分光光度法和UHPLC-MSPAG3M中一致地显示出更高的葡萄糖消耗和ATP，DPG和乳酸的产生，其含有的葡萄糖初始剂量为SOLX和ESOL5的一半。特别是，尽管细胞内pH值较低，但PAG3M在整个储存过程中更好地保留了DPG水平，其次是SOLX和ESOL-5。

尽管PAG3M显示出最高的磷酸景天庚酮/6-磷酸葡萄糖酸盐的比例，而ESOL-5最低（图2.C).在没有通量数据的情况下，这一观察结果表明，在PAG3M储存的红细胞中，通过磷酸戊糖途径（PPP）的通量增加，表明NADPH产生（即氧化硫醇还原）的能力更高。

ESOL-5和SOLX的细胞内苹果酸水平最高（所有添加剂的储存量下降，可能是由于在上清液中释放），尽管前一种添加剂中的柠檬酸盐含量较高。

代谢连锁分析允许测定储存在不同添加剂中的红细胞的代谢重编程。这种方法的基本原理是酶促反应的生化约束导致相同途径中代谢物之间具有强烈且显着的正/负相关性，除非级联中一种酶的活性被调节事件上调/下调。

SAGMRBC中的代谢物水平相互关联，然后对所有添加剂重复类似的相关性分析，同时保持SAGM中原始阐述的代谢物顺序或以逐加的方式执行相关性的分层聚类（图3.B).该分析一目了然地概述了添加剂之间的代谢重新布线，表明与SAGM相比，对碱性添加剂中的氧化还原稳态，羧酸，脂肪酸和嘌呤代谢有很强的影响。

值得注意的是，在总谷胱甘肽水平方面，在添加剂中观察到谷氨酰胺代谢和谷胱甘肽稳态的变化。SAGM在储存的前21天显示出最高的GSSG水平。与其他添加剂相比，半胱氨酸在储存期间在ESOL-5红细胞中显着积累，主要是在储存第56天的单位过期时。

嘌呤和脂肪酸代谢

与本文测试的所有其他添加剂相比，在PAGGSM和PAG3M中补充鸟苷导致鸟嘌呤和腺苷水平显着升高，肌苷（尤其是PAG3M）水平相对较低（图4).这表明来自PAGGSM和PAG3M的鸟苷主要通过磷酸分解而不是次黄嘌呤鸟苷磷酸核糖转移酶（HGPRT）代谢。

脱氨嘌呤在PAG3M中最低，另一方面，尿酸盐与黄嘌呤的比率在ESOL-5和SAGM中最高，其次是SOLX（图4).从稳态数据推断，这些结果表明SAGM和ESOL-5中的嘌呤脱氨和分解代谢尿酸盐增加，部分缓解了SOLX。

代谢组学数据与功能结局的相关性

代谢组学数据与功能结局（包括由ATP水平确定的能量状态、溶血、渗透脆性、PS暴露和形态改变）相关和与添加剂无关的方式，所有添加剂中与ATP具有显著正（红色）或负（蓝色）相关性的顶级代谢物概述见图,A。

值得注意的是，观察到的大多数趋势都显示出越来越高的趋势（例如乳酸和ATP–图5.B）或所有添加剂的相关性较低（例如ATP和1-磷酸鞘氨醇）（图5.A).除PAG3M（图5.C），建议重新布线特定于该添加剂的Rapoport-Luebering分流器。

值得注意的是，嘌呤代谢物（尤其是ATP、腺苷和脱氨产物肌苷和莨菪嘌呤）与功能结局的相关性最好，次黄嘌呤是所有添加剂中溶血和形态改变（20%棘皮细胞）的最佳预测因子。值得注意的是，肌苷是除SAGM。

结论：

在本研究中，我们首次对储存在不同碱性添加剂SOLX，ESOL-5和PAG3M或非碱性/经典添加剂中的红细胞进行了比较代谢组学分析，我们的代谢分析结果表明，与其他碱性添加剂相比，PAG3M中的红细胞保存效果更好，并且通常，与非碱性SAGM和PAGGSM相比，在碱性添加剂中具有更好的红细胞保存效果。

特别是，与SAGM和PAGGSM相比，PAG3M和其他碱性添加剂的DPG和ATP的产生和维持，以及嘌呤代谢和氧化还原稳态（特别是PPP及其非氧化相副产物）是有利的，然而，观察到的代谢益处并未扩展到预防储存诱导的脂肪酸释放和脂质氧化。

来自这些途径的代谢物与功能结局的替代离体指数的相关性是相关的，因为它们证实并扩展了最近对嘌呤脱氨在输血后红细胞恢复中的作用的观察，然而，额外的功能性体内测量将有助于进一步扩展我们对这些储存添加剂对输血功效影响的理解。

本研究的结果为碱性储存添加剂的代谢益处提供了额外的见解，并可能在不久的将来指导新型添加剂的配方。