Adv. Sci.│ L-山梨酮脱氢酶催化机制的结构研究

今天推送的文章是2023年10月发表在AdvancedScience上的“StructuralInsightintotheCatalyticMechanismsofanL-SorbosoneDehydrogenase”，通讯作者是来江南大学的周景文教授。

2-酮基-L-古龙酸(2-KLG)是工业维生素C生产的直接前体。目前工业生产维生素C的方法是经典的两步发酵路线(图1A)。经典的两步发酵路线方法需要三种细菌参与，使得过程复杂且成本较高。在以前的报道中，通过基于2-KLG还原酶的高通量筛选获得了可以直接将D-山梨醇转化为2-KLG的菌株。在中，D-山梨醇通过PQQ依赖性山梨醇脱氢酶(SLDH)或/和黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)依赖性SLDH转化为L-山梨糖。然后，依赖于FAD的山梨糖脱氢酶(SDH)将L-山梨糖转化为L-山梨酮。最后，L-山梨酮通过NAD(P)+依赖性L-山梨糖脱氢酶(SNDH)进一步转化为2-KLG(图1B)。以前的研究表明，FAD依赖性SDH的异源过表达可以产生少量的2-KLG，而与NAD(P)+依赖性SNDH共表达可以大大增加2-KLG的产量。因此，阐明其结构和催化机理对于提高SNDH的性能和2-KLG的生产效率至关重要。

序列分析表明，的SNDH属于醛脱氢酶超家族(ALDH-SF)。ALDH以NAD(P)+为辅因子，在生物体有毒醛酮代谢中起关键作用。它们的整体结构大体相似，但催化活性却高度不同。ALDH亚家族中的底物通道差异较大，使得它们具有很高的底物多样性。目前还没有关于SNDH亚家族结构的报道，其催化机制和底物特异性的结构基础也尚不清楚，限制了SNDH的理性设计。因此本研究的目的是解析的SNDH的催化机理，并进行半理性设计以提高SNDH的催化活性。

封闭底物口袋的氧化型SNDH(O-SNDH)的结构分析

与ALDH-SF的其他成员一样，SNDH具有三个典型结构域:连接结构域(红色)、催化结构域(黄色)和辅因子结合结构域(绿色)(图2A)。虽然SNDH的整体结构与ALDH-SF的其他成员相似，但一个显著的区别是单体结构中的底物口袋具有“封闭构象”，因为在结构的表面显示中没有观察到底物口袋(图3A)。这种封闭的构象是催化环(Ile288-Ser300)向蛋白质外部延伸的结果。催化环中的催化半胱氨酸(Cys296)和相邻半胱氨酸(Cys295)之间形成二硫键。这一有趣的现象表明SNDH的催化环具有运动性，这可能是由Cys295和Cys296的氧化还原状态控制的，从而调节底物口袋的打开和关闭。SNDH底物口袋的闭合状态结构被命名为O-SNDH。

突变体C296A的结构分析

为了证明催化环受二硫键动态调控的假设，将催化残基Cys296突变为Ala。突变体C296A每个二聚体的两个亚基之间有两组相互作用(图2C、D)。与O-SNDH相比，突变体C296A的催化环表现出显著的差异。由于无法形成二硫键，所以催化环进入蛋白内部，这使得底物口袋呈现开放构象(图3B)。此外，辅因子口袋在蛋白质表面有一个广泛的带正电荷的开口，可以接受NADP+的单磷酸腺苷(AMP)部分和焦磷酸基(图4A)。辅因子口袋与底物口袋连接形成辅因子-底物-通道，NADP+的烟酰胺环位于其中(图4B)。在C296A、Thr160、Lys186和Gln224的辅因子口袋中，腺苷核糖处于稳定状态。Lys186，Gly219和Glu189的骨架酰胺基团与2’-磷酸基团相互作用。Trp162和Ser240的主链酰胺基团与焦磷酸部分结合。Leu263和Glu294通过氢键稳定烟酰胺核糖(图4C)。

开放底物口袋的还原型SNDH(R-SNDH)的结构分析

为了验证二硫键的形成是否是影响催化环运动的关键因素，通过在结晶条件下加入二硫苏糖醇(DTT)分析了R-SNDH的晶体结构。与C296A突变体一样，R-SNDH也呈现同源四聚体状态，并且每个亚基具有与突变体C296A相同的作用模式。与预期相符，R-SNDH具有开放的底物口袋，其中Cys295和Cys296不能形成二硫键，Cys296的巯基朝向辅因子口袋，阻断了辅因子-底物通道(图3C)。辅因子NADP+在R-SNDH中的位置不同于C296A。在R-SNDH中，NADP+的烟酰胺环延伸到溶剂区(图4D)，该构象导致Cys296的巯基阻断辅因子-底物-通道，导致SNDH的辅因子通道无法容纳NADP+的烟酰胺环(图4E)。与C296A相比，R-SNDH与NADP+的相互作用发生了改变。在R-SNDH中，虽然烟酰胺环具有较大的构象变化，但它仍然与Glu294形成氢键。焦磷酸部分失去与Trp162的相互作用，并与Gly239形成氢键(图4F)。随后测定R-SNDH和O-SNDH中游离Cys残基的含量。结果表明，R-SNDH中游离半胱氨酸含量(0.089±0.003)高于O-SNDH(0.027±0.003)。这表明O-SNDH能够形成二硫键，从而形成封闭构象。

SNDH的动态调控及催化机理

许多研究表明，体内产生的活性氧类(ROS)可以调节氧化还原介导的蛋白质。为验证SNDH是否受氧化还原环境调控，测定了SNDH对不同浓度H2O2的敏感性。结果表明，当H2O2达到200μm时，SNDH几乎失去了活性(图5A)。加入DTT后，活性显著恢复。此外，72h后细胞内H2O2含量仍保持在100µm以上(图5B)，这可能使SNDH失活。基于2-KLG的结构信息及其在生物合成中的作用，提出了SNDH通过体内氧化还原状态的调节机制(图6A)。在中，L-山梨糖脱氢酶将L-山梨糖氧化为L-山梨酮并生成FADH2，以氧作为最终电子受体还原FADH2生成H2O2。此外，在众多的氧化还原反应中会产生大量的ROS。ROS的存在可使催化环上的Cys295和Cys296形成二硫键，使R-SNDH变为O-SNDH，无催化活性。当O-SNDH处于合适的还原环境时，可转化为具有催化活性的R-SNDH(图6B)。

此外，通过突变实验验证了SNDH的分子催化机理。多序列比对显示SNDH中潜在的活性位点残基(Cys296，Glu262，Asn163和Gly293)在ALDH-SF中高度保守，并且仅在Arg172和Glu471处发生差异(图1D)。当这些氨基酸残基突变为Ala时，突变体的酶活性极低甚至消失(图5C)。随后，通过结构分析和ALDH催化机理的报道，提出了SNDH的催化机理(图6C)。在R-SNDH的结构中，NADP+的烟酰胺环不能进入辅因子口袋，因为催化残基Cys296占据辅因子口袋的一部分。在突变体C296A中，由于Ala296没有巯基，可以为NADP+留下足够的空间进入底物辅因子通道。这表明在反应过程中SNDH可能首先接受底物，这使得Cys296的巯基指向底物口袋。由于Cys296的巯基发生偏转，NADP+的烟酰胺环可以正确地进入辅因子通道完成电子转移。随后，Glu262作为通用碱，激活水分子攻击硫酯中间体，完成底物反应催化，释放相应的羧酸产物和NADPH。

SNDH的动态调控机制的探讨

为了研究O-SNDH从“开放到封闭”的转化和R-SNDH从“封闭到开放”的转化，作者进行了受控分子动力学模拟和伞式采样。计算结果表明，O-SNDH中催化环的闭合需要43.4kcalmol−1的自由能。而R-SNDH催化环的打开过程需要62.9kcalmol−1的自由能，说明打开过程不如关闭过程有利。闭合和打开过程自由能的差异可能是由于O-SNDH中催化环与附近α-螺旋(Lys96-Ala110)的相互作用以及催化环与重建的环(Glu457-Trp468)的相互作用所致。

为了研究Cys295和Cys296之间二硫键的裂解和形成，在之前研究的基础上进行了量子化学计算。在由DTT介导的二硫键的断裂过程中(图7)，最终产物络合物(PCa)产生的能量相对于RCa为-23.4kcalmol-1。解离过程的总能量屏障为27.5kcalmol-1(IC1a到TS3a)。

在H2O2介导的二硫键形成过程中(图7)，Cys296的巯基上的硫原子攻击H2O2中的氧原子，H2O2从反应物络合物(RCb)到过渡态(TS1b)的能垒为19.0kcalmol−1。然后生成中间配合物(IC1b)，相对于RCb的能量为-46.8kcalmol-1。最后，二硫键形成后，生成产物配合物(PCb)，相对于RCb，其能量为-62.8kcalmol-1。速率决定步骤是二硫键形成步骤，其能垒为27.6kcalmol−1(IC1b到TS2b)。

由于半胱氨酸的巯基在实验pH值(pH=8.0)下可以去质子化，因此作者还研究了质子化后的Cys295与Cys296之间的二硫键形成过程(图7C)。计算结果表明，二硫键形成过程也是限速步骤，其能垒为48.3kcalmol−1。高能势垒的产生可能是由于在第二过渡态产生第二个氢氧化物离子或在第二过渡态两个去质子化半胱氨酸和羟基之间的不利相互作用。简而言之，二硫键断裂过程的总能垒(27.5kcalmol−1)与二硫键形成过程(质子化半胱氨酸，27.6kcalmol−1)相似，表明二硫键的形成和断裂是可逆的。

修饰空间位阻提高SNDH的催化活性

在此基础上，尝试对SNDH的位阻进行修饰以提高其催化活性。首先，使用分析SNDH的底物通道。通道显示由Phe164、Met167、Glu171、Val297和Arg445组成的明显瓶颈区域(图8A)。为了扩大瓶颈区域，首先使用CDOCKER将L-山梨酮放置在SNDH的底物通道中。根据保守性分析，选择Met167和Val297作为突变位点以拓宽SNDH底物通道的瓶颈区域(图8C、D)。

通过两个原则进行SNDH突变体的构建。分别用带有大侧链1）或小侧链2）的氨基酸对Met167和Val297进行替换，研究SNDH瓶颈区通道变窄或者变宽对酶活性的影响。结果显示，根据原理1)构建的突变体活性有不同程度的下降;而根据原理2构建的突变体，除M167A外，活性均有所增加(图8E)。其中，M167L比活性提高了2.7倍，V297A比活性提高了1.2倍。最后组合突变体M167L/V297A的比活性比SNDH提高2.9倍(图8E)。

通过测定SNDH和代表性突变体(M167L、V297A和M167L/V297A)的动力学参数，研究突变体对L-山梨酮催化效率的影响。结果表明，M167L、V297A和M167L/V297A比活性的增加分别归因于Km值的降低和kcat值的增加。

目前，有关一步发酵生产维生素C的研究主要集中在2-kLG合成途径的代谢工程学，而很少有研究从所涉及的关键脱氢酶的结构来了解其催化机制。该研究表明，SNDH催化相比于经典的两步发酵路线更适合作为L-山梨糖酮特异性催化酶用于代谢工程学。通过对其晶体结构的分析，发现了二硫键介导的SNDH氧化还原调节机理，并提出了SNDH的分子催化机制。此外，通过对SNDH底物通道的分析，获得了活性增强的突变体。本研究有助于深入了解中SNDH的生理调控机制，丰富了ALDH-SF的催化机制，为今后SNDH或ALDH的应用提供了理论依据。