Castleman病预后相关的体细胞突变

Castleman病是一种异质性的淋巴细胞增殖性疾病，除了HHV-8感染相关之外，无明确诱因的称为特发性多中心Castleman病，其发病机理及预后因素等目前都不清楚。

钱文斌教授团队通过对特发性多中心Castleman病标本的全外显子测序鉴定出了五个与预后相关的新的体细胞突变，可以用于预后的评估。而进一步对四个患者共存的NCOA4L261F突变体的研究发现该突变可能改变了NCOA4蛋白的特性和功能，从而参与到Castleman病的发病过程中。本研究为特发性多中心Castleman病的预后评估和发病机理以及治疗靶点都提供了新的思路。

研究背景和目的

Castleman病（CD）是具有明显异质性的淋巴细胞异常增生性疾病。根据淋巴结肿大区域可分为单中心CD（UCD）和多中心CD（MCD）。大约一半的MCD病例是由人类疱疹病毒8（HHV-8）感染引起的，而其他HHV-8阴性的且病因未知的病例被称为特发性MCD（iMCD）。血清IL-6水平升高一直以来被认为与iMCD发病相关，但一些患者的IL-6水平正常或仅有轻度升高。

此外，两项临床对照试验表明，靶向IL-6的西妥昔单抗（siltuximab,）对超过一半以上（66％）的MCD患者无效。这些结果提示该疾病可能不完全由IL-6通路驱动。近年来，尽管某些研究已经发现iMCD中存在克隆异常，但仍缺乏用于监测这些患者预后的生物靶标。

在本研究中，对22例iMCD患者石蜡组织进行全外显子测序（WES），并分析了这部分患者体细胞基因组改变与临床预后的关系。

研究方法与结果

从2010年1月至2018年7月，收集浙江大学附属第一医院诊断出的22例iMCD患者。所有病例均由两名经验丰富的病理学家独立审核并根据MCD诊断标准共识确定诊断。根据病理组织切片潜伏期相关核抗原免疫细胞化学的结果来确定HHV-8感染状态。根据组织病理结果，有4例（18.2％）透明血管型和18例（81.8％）浆细胞型。患者的中位年龄为57岁（范围：29-76岁）。

使用Kaplan-Meier方法分析发现，这些患者中位OS（总生存）未达到，一年，两年和五年的累积OS率分别为77.3％，68.2％和61.4％。截止2019年6月30日，仍有14名患者（636％）存活，中位随访时间为42个月（范围：25-101个月）。值得注意的是，这些患者仅在诊断后两年就发生了死亡事件。根据生存时间，将这些患者进一步分为两组：OS24（24个月总生存）未达到组（n=7，中位OS为3个月，95％CI：0-8.132）和OS24达到组（n=15，中位OS未达到）（图1A）。两组患者在年龄，性别，ECOG评分，病理亚型，B症状，实验室结果，影像学检查和治疗方案等方面均无统计学差异。

为确定iMCD患者的遗传特征，对这22例患者进行了全外显子测序（WES）。患者的成对唾液样本及10个反应性淋巴结作为对照。通过分析WES结果，共鉴定出7195个非沉默的体细胞突变（平均值=327，中位数=240，范围：119-1071）。

使用比值比和X2检验发现其中五个基因（NCOA4，DARS2，MTCL1，RABPE1和DNAH11）改变与患者预后不良相关（图1B）。通过Sanger测序证实了等位基因突变频率（VAF）大于10％的突变体。这些体细胞突变可以作为iMCD的预后靶标。

四名患者中核受体共激活因子4（NCOA4）的SNVs均位于同一氨基酸位点，突变预测导致（L261F）突变。研究认为，该基因在iMCD发病中具有重要作用。最近的研究表明，NCOA4的表达和功能异常参与癌症的发生。多种肿瘤细胞系中已经观察到NCOA4表达的增加。对NCOA4氨基酸序列分析表明，NCOA4中L261F的改变影响了高度保守的ARA70结构域II（氨基酸138–332），而这是芳烃受体（AhR）选择性共激活所必需的（图2A）。比较不同癌症的突变频率发现，iMCD的NCOA4突变发生率最高（23％，5/22）（图2B）。但在其他肿瘤中未发现NCOA4L261F突变，表面该突变对iMCD具有高度特异性（图2C）。

通过计算机辅助结构分析来了解错义突变对NCOA4蛋白表型的影响。通过使用I-TASSER对野生型和突变体的三维结构进行同源性建模。图2D展示了PyMOL可视化的蛋白质结构和突变位点。使用DUET软件分析发现L261F突变导致了NCOA4蛋白质的不稳定（-1.617Kcal/mol）。另外，用UCSFChimera程序预测突变氨基酸与其侧链在原子水平的对接。结果提示突变导致原子间距离太近二不利于相互作用。这些结果表明，突变的氨基酸残基Phe干扰了其周围的残基（图2E）。因此，L261F的突变可能会导致NCOA4蛋白的极性改变。通过免疫印迹检测NCOA4野生型和突变体的蛋白表达水平，发现L261F突变会导致其表达上调（图2F）。总之，这些结果表明L261F突变可能改变了NCOA4蛋白的特性和功能。

最近有研究发现了包括有丝分裂原激活的蛋白激酶（MAPK）在内的几种参与iMCD发病机制的信号通路，而MAPK是IL-6激活的主要途径之一。MAP激酶的活化也被证明在雄激素受体（AR）的转录激活中起着重要作用，AR是ARAs（如NCOA4）的共激活受体。另外，已经证明MAPK/AR-ARAs信号轴的过度活化与肿瘤的进展和化疗耐药相关。基于这些研究证据，研究者推测MAPK/AR-ARAs是受NCOA4突变体调控的潜在信号分子途径，一些靶向抑制ARAs的药物可开发用于iMCD的治疗。

研究结论

通过22名iMCD患者的WES分析发现了具有预后价值的新候选基因突变。NCOA4L261F突变体可能在iMCD的发病机制中发挥关键作用。当然，这也需要进一步的大样本研究以证实这些发现并探索相关分子机制。

图1Kaplan–Meier曲线分析基因突变与生存预后的关系

图2L261F突变改变了NCOA4蛋白的分子特性和表达水平